先看结论：三个决策点
- 无 RT 对照用于判断扩增信号是否来自 DNA。
- DNA 去除强度与 RNA 完整性需要同时考虑。
- 优化前先确认污染发生在提取、处理还是扩增设计。
用对照确认 DNA 残留
吸光比无法直接证明样本中没有基因组 DNA。对同一样本设置无 RT 对照，可以观察不经逆转录时是否仍出现扩增。
提取空白和无模板对照则帮助区分试剂或操作环境带来的信号。
- 无 RT 对照
- 提取空白
- 无模板对照
- 同一样本平行设置
回看提取与 DNase 处理
组织量过高、裂解或均质不充分、相分离扰动和柱/磁珠负载超出方法范围都可能增加 DNA 残留。
DNase 处理需要验证 DNA 去除和 RNA 保存之间的平衡，并按产品说明书设置处理和终止步骤。
- 核对样本输入
- 检查裂解与分离
- 记录 DNase 条件
- 处理后复核 RNA 质量
必要时调整扩增设计
如果研究设计允许，可评估跨外显子连接处的引物策略；但引物设计不能替代样本质量控制。
问题修正后应在独立提取批次中复核。
- 复核引物特异性
- 保留无 RT 对照
- 独立批次重复
- 记录偏差与修正
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FAQ
常见问题
RNA 的 260/280 正常是否说明 DNA 已去除？
不能。DNA 残留宜结合无 RT 对照或针对性检测判断。